METHODES UTILISEES
Pour caractériser les canaux Na+, Cl- et K+ nous appliquons une stratégie qui combine l'enregistrement par patch-clamp de l'activité d'un canal unique et simultanément l'enregistrement des conductances membranaires macroscopiques, les activités ioniques intracellulaires et la mesure du courant au travers d'épithéliums montés dans des chambres de Ussing miniatures sur le plateau d'un microscope inverse. L'utilisation d'amplificateurs de haute impédance, du traitement digital du signal et des techniques informatiques à grande vitesse rendent possible la description de la fonction des canaux ioniques en termes moléculaires.
La différence de potentiel existant entre deux faces d'un épithélium (Vt) ou d'une membrane plasmique (Vm) est due aux mouvements d'ions se produisant à travers la membrane étudiée; elle est assimilée à un potentiel électrique (en mV). Ainsi, l'amplitude du courant électrique (I) traduit le courant d'ions se produisant à travers un épithélium, une membrane ou un canal ionique. En imposant à la membrane différents potentiels, une courbe de relation courant-voltage est tracée et la conductance (G=I/V) correspondante peut être déterminée.
En électrophysiologie le sens du courant est donné par le sens de déplacement des charges positives; ainsi un courant entrant peut être du aussi bien à l'entrée de cations dans la cellule, qu'à la sortie d'anions de celle-ci.
Pour un ion donné (x), le potentiel d'équilibre, c'est à dire la valeur du potentiel généré par la diffusion de x à travers une membrane qui lui est perméable, est le potentiel de Nernst (Ex).
Ex = RT/ZF ln ( xe/xi )
avec R: constante des gaz parfaits, T: température absolue (øK), Z: valence,
xe: concentration externe en ions x,
xi: concentration interne en ions x.
L'équation de Goldman, Hodgkin et Katz (GHK), dérivée de l'équation de Nernst, permet d'exprimer la différence de potentiel membranaire en tenant compte de la perméabilité de cette membrane aux différents ions qui la traversent.
Ei = RT/F ln (PKKe + PNaNae + PClCli / PKKi + PNaNai + PClCle)
avec Er: potentiel d'inversion de la membrane, c'est à dire le potentiel auquel le courant change de sens et Px: perméabilité de la membrane à l'ion x.
L'équation de GHK rend compte, contrairement à la prédiction de la loi d'Ohm, de la non linéarité des courbes de relation courant-voltage, observée pour différents types de canaux ioniques, Le flux d'un ion à travers une membrane est en effet plus facile à partir du compartiment ayant la plus forte concentration en cet ion perméant.
Le COURANT DE COURT CIRCUIT
LES MICROELECTRODES INTRACELLULAIRES
En pratique l'épithélium est placé en position horizontale dans une chambre de Ussing, la membrane basolatérale étant dirigée vers le haut et accessible à la microélectrode fabriquée à partir d'un capillaire en borosilicate étiré automatiquement puis rempli d'une solution de KCl. La résistance à la pointe de la microélectrode plongée dans une solution de Ringer est de l'ordre de 50 mégaohm. La détermination de la conductance membranaire lors de modifications du contenu ionique des solutions baignant l'épithélium, ainsi que l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques permettent l'identification des ions transportés à travers la membrane basolatérale.
LE PATCH-CLAMP
Cette technique mise au point par Neher et Sakman en 1976 leur a valu le prix Nobel de médecine en 1991. Elle permet de détecter les courants ioniques traversant un canal individuel. Une microélectrode de verre, polie à son extrémité, est approchée de la membrane cellulaire. Par une aspiration douce, elle est collée au fragment de la membrane ou "patch". La résistance électrique entre le contenu de la microélectrode et le milieu baignant les cellules est supérieure à 1 gigaohm, au niveau du point de contact.
Les courants unitaires et totaux recueillis par la microélectrode de "patch" sont amplifiés, visualisés sur oscilloscope et enregistrés sur cassette vidéo. Ces signaux sont ensuite numérisés et filtrés par un convertisseur analogique/numérique puis analysés à l'aide d'un ordinateur. Un logiciel permet l'analyse semi-automatique des signaux numérisés. A partir de la détermination par l'utilisateur, de la ligne de base et de l'amplitude du courant unitaire, sur un enregistrement de longeur choisie, la durée des états ouverts, des états fermés et des sous-états, sont détectés par le logiciel. Les histogrammes des durées d'ouverture et de fermeture peuvent être tracés et les durées moyennes de l'état ouvert ou de l'état fermé sont déterminées. De plus le rapport entre la durée totale des ouvertures et la durée totale des états détectés donne une estimation de la probabilité d'ouverture du canal étudié.